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专家分享——土壤有机氯农药分析的经验

本文作者:湖北省生态环境监测中心站、环境监测分析测试中心(湖北省持久性有机污染物检测研究中心、国家环境二噁英监测中心华中分中心)刘彬老师


本文归属权为作者与本公众号共同所有,仅作学习交流,请勿商用。


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有机氯农药(Organochlorine Pesticides,OCPs)一直是土壤环境监测关注度很高的有机污染物,相关的检测技术也是环境有机分析人员的必备技能之一。该任务虽然常见,但并不简单,虽然基础,关键点却很多,常常是新人的拦路虎,老人的日日谈。本文就和大家聊聊土壤有机氯农药分析的一些经验和要点。


一、针对有机氯农药的环境监测为啥热度不减?


有机氯农药曾经是全球性的热门杀虫剂,它的种类非常多,包括六六六、滴滴涕、七氯、环氧七氯、六氯苯、氯丹、硫丹、灭蚁灵、毒杀芬、艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂、异狄氏醛、硫丹硫酸盐、甲氧滴滴涕等等。


其中在我国生产和使用率最高的是六六六(由多个同分异构体组成)和滴滴涕(由DDT和其降解产物DDD、DDE组成)两类。


有机氯农药具有类雌激素和“三致”(致癌、致畸、致诱变)作用,虽然我国已于20世纪80年代在农业领域全面禁用,但因其理化性质稳定,如林丹(γ-六六六)降解率达到95%需要10年左右,滴滴涕则需要长达30年,所以至今仍可在各类环境土壤中检出,而且时常出现高残留点位。


国家近期发布的两项土壤污染风险管控标准GB15618-2018和GB36600-2018都有所涉及。



二、搞懂原理是第一步!


有机氯农药、多环芳烃、邻苯二甲酸酯、酚类化合物等都属于半挥发性有机物(Semi-volatile Organic Compounds,SVOCs),其土壤样品的分析原理是一样的:


第一步,想办法将土壤中的目标化合物转移到可以上机的试液中;第二步,完成仪器测定。


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图1 土壤SVOCs分析流程


1.“前处理”原理


把土壤中目标化合物转移到可以上机试液中的过程叫“前处理”(就是仪器测定前的样品处理),一般包括萃取、净化和浓缩。


萃取就是根据目标化合物性质,利用“相似相溶”原理选择合适的有机溶剂,对土壤样品进行浸提,使目标化合物从固相进入液相;


但土壤基质非常复杂且大部分萃取溶剂不具有选择性,所以除目标化合物外,萃取液中会存在大量共萃物(以色素居多),直接上机会污染仪器,于是需要在保留目标化合物的同时去除干扰物,这个过程就叫净化;


萃取液体积大、浓度低,一般需要通过浓缩来达到仪器的测定下限。


2.仪器测定原理


我们日常分析的有机氯农药都是混合物,但不管是ECD还是MSD检测器都不具有从混合物中分辨出目标化合物的能力,所以在进检测器前要先利用气相色谱进行化合物的分离。


试液在进样口气化(进样口温度很高),随载气进入气相色谱部分并迅速在色谱柱前端冷凝液化(柱箱初温低),再通过程序升温进行化合物的分离(利用化合物气化温度不同以及与色谱柱固定液吸附力的差异),最后各化合物依次进入检测器被检测。



三、那么多方法,我怎么选?


目前国家发布的土壤有机氯分析方法标准包括《土壤中六六六和滴滴涕的测定 气相色谱法》(GB/T14550-2003)、《土壤和沉积物 有机氯农药的测定 气相色谱-质谱法》(HJ835-2017)、《土壤和沉积物 有机氯农药的测定 气相色谱法》(HJ921-2017)等,可以对各环节进行拆分比较。


1.样品选择


GB/T14550-2003使用风干样品进行分析,HJ835-2017可以使用新鲜样品或者冻干样品,HJ921-2017则只能使用新鲜样品。


采用新鲜样品直接分析,简单快速,但是我省大部分土壤的干物质含量都低于80%,泥巴状的样品更是十分常见,不容易与干燥剂混匀,而且需要对萃取液进行除水,引起化合物的损失;


风干一般是指将样品摊于洁净容器上避光、自然晾干,也可使用土壤风干箱(增加小流量氮吹功能),但过程都较为缓慢,耗时很长(潮湿天气半个月都干不彻底),后续仍需对萃取液进行除水;


冻干样品的获得需要借助冷冻干燥机,每台机器一次可以冻干20个左右样品,时间在20~30小时之间,样品均匀性好,后续不必除水。


综合比较,如果样品含水率不高、样品量大、时间紧,建议选择新鲜样品进行分析;


若样品含水率高、量小、对准确度要求很高,建议使用冷冻干燥样品进行分析;


风干样品在时效性、便捷性和准确性上都不具有优势,不推荐。


2.样品萃取


GB/T14550-2003是先采用1+1石油醚:丙酮对样品进行索氏提取,再用石油醚进行液液萃取,HJ835-2017和HJ921-2017都是以1+1正己烷:丙酮为萃取剂,对样品进行索氏提取或加速溶剂萃取。索氏提取是利用萃取剂在回流和虹吸条件下对样品进行反复萃取的一种经典方法,装置中每次接触样品的都是冷凝回流的新溶剂,使样品内外保持浓度差,实现动态提取,成本低且萃取效果好。


缺点是耗时较长(16~24小时),有机溶剂使用量较大;加速溶剂萃取(Accelerated Solvent Extraction,ASE)是将样品置于加热炉里的不锈钢萃取池中,在高温、高压下使样品被液态萃取剂溶出,耗时短(每20min处理6个样品),萃取效率高、溶剂用量少、自动化,但对装置的性能要求很高(部分厂家的加速溶剂萃取仪压力控制能力不足,导致萃取重复性和重现性差)。


综合比较,若对测试成本有要求,建议选择索氏提取法,可多采购一些提取器和加热套,多个样品同时萃取;


若已配备加速溶剂萃取仪,可以多采购一些萃取池,样品量大时可不间断萃取。


3.萃取液净化


净化过程不是必须的,但是共萃取多(颜色深或基质浊)的萃取液必须净化,否则会在仪器中产生活性位点导致目标化合物的降解或吸附。


GB/T14550-2003采用的是浓硫酸净化法和柱层析净化法,HJ835-2017可使用硅酸镁净化法(柱层析或商品化小柱)和凝胶色谱净化法(Gel Permeation Chromatographic,GPC),HJ921-2017只使用硅酸镁商品化小柱净化法。


浓硫酸净化法是使干扰物发生磺化反应,从而脱离有机相进入水相,最后分离水相,起到净化有机相的作用,但操作过程危险系数较高;


凝胶色谱净化法是利用目标化合物和干扰物(一般是大分子)的粒径不同,在多孔凝胶中的排出时间不同,从而分段收集流出液的净化方法,但多孔凝胶柱需要定期维护(样品量大时很难保证),否则不仅起不到净化作用,还会污染样品;


硅酸镁吸附剂(也叫弗罗里硅土,Florisil)可以吸附极性物质(色素、腐殖酸等都具有较强极性)、排出极性不强的目标化合物,经常用于农药类有机污染物的基质净化,商品化小柱填料比手工层析柱均匀,能防止干扰物从缝隙流出而不被吸附,价格也很便宜,但在购买时要注意规格(1000mg/6mL的比500mg/6mL的填料多、净化效果好)。


4.萃取液浓缩、除水


GB/T14550-2003使用旋转蒸发法,HJ835-2017和HJ921-2017则未指定浓缩方法。氮吹浓缩最为常见,成本低、可批量操作,但要控制好气流和水浴温度;


旋转蒸发仪环境密闭、损失小,但一般1台仪器只能处理1个样品,样品量大时不太实用,且收集瓶无刻度线、浓缩液量不好控制;


平行蒸发仪虽可以批处理,但由于其构造原因,需要打开上盖才能观察浓缩液的剩余量,所以需要不断抽、泄真空,不太方便。


综合考虑,氮吹浓缩最实用。


气相色谱类仪器不能进水相(会破坏色谱柱固定液),所以含水率高的萃取液一定要除水;另外,若水除不彻底,浓缩和转溶剂过程也会很艰难。


一般使用无水硫酸钠对萃取液进行除水,推荐的方法是将无水硫酸钠加入萃取液中,直至新加入的无水硫酸钠不再结块,再将其通过垫有滤纸或玻璃棉的小漏斗转入收集瓶中(这种方法比装有无水硫酸钠的小漏斗除水更彻底)。


5.仪器分析


有机氯农药的仪器分析一般使用气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)或气相色谱-质谱仪(GC-MSD)。


土壤基质非常复杂,GC-ECD只能通过保留时间定性,在排除假阳性上存在缺陷,即使是双柱-双ECD检测器法也不能避免(在分析土壤样品时,小杂峰一个接一个,基本不会出现一根柱子上有目标化合物检出而另一个没有的情况),当测定结果高于方法检出限又不能排除假阳性的情况下,只能保留,对后续数据统计和结果上报增加不小的难度;


GC-MSD虽然在灵敏度上不具优势,但已能满足环境管理需求,重要的是它能通过检查化合物质谱碎片信息,在很大程度上排除假阳性:同时开启全扫(SCAN)和选择离子扫(SIM)模式,SCAN定性、SIM定量,当目标化合物有检出时,调看SCAN谱图,碎片不全或丰度比不对的基本都是假阳性,直接删除,这样处理下来,数据结果不仅可靠而且清爽。



四、准备工作有很多,别忽视!


在开始土壤有机氯农药分析前,有很多准备工作一定要做好,否则后面的实验很可能会乱七八糟。


首先,要设计好实验方案。

针对本实验室条件和选用的方法标准,制定具体的实验方案,包括化合物的选择、分析方法的确定、仪器参数的预判、操作流程、样品数量的统计、质控措施等各环节,绝不能在稀里糊涂的情况下就直接开始了。


第二,要准备好材料并保证仪器状态。

实验开始前,对照实验方案检查标准品是否在保质期内,材料(萃取溶剂、气、干燥剂等)是否充足;前处理和测试仪器前也要先进行状态测试,如索氏提取器是否破损,加热套是否控温,加速溶剂萃取仪和氮吹仪气路是否畅通,质谱调谐是否合格等等。


第三,先建立可靠的化合物定性定量方法。

很多人都习惯先做前处理,最后在测试仪器上建立定性定量方法,这样是有风险的,尤其是在方法验证阶段(仪器测不测得准都不知道,前处理做那么久有啥意义?)。应先保证化合物正常出峰,标准曲线各项参数合格,再对有证标准物质(与标准曲线所用的标准物质编号不同)进行测定,结果合格方可开展其他实验。



五、利用“质控”来“自控”,心里有数才踏实


1.空白实验


空白实验是以石英砂代替土壤样品,完成全部分析流程。


测定结果中目标化合物浓度不应超过方法检出限。有机分析中是不扣空白的,它用来考察目标化合物的实验室本底情况,若有检出则要检查试剂、材料和实验各环节,并想办法去除本底。


2.有证标准物质


液体有证标准物质可以考察标准曲线的准确性;土壤有证标准物质可以考察批次样品分析过程的准确性,且比液体加标样品可靠,因为液体加标后不能与土壤样品充分吸附,很容易被溶出,会出现加标回收率正常但实际萃取率低的情况。


所以在方法验证和能力考核中,还是建议对土壤有证标准物质进行分析。


3.替代物回收率


替代物是与目标化合物性质相似、但自然环境中不存在的物质(常见的有多氯、多溴、多氟取代物或目标化合物的氘代物),它们在前处理之前加入,与样品中目标化合物一起被测定,用来监控每个样品的分析过程(传统的目标物加标实验不能监控每一个样品)。


HJ835-2017中可以使用十氯联苯、四氯间二甲苯或氯茵酸二丁酯,且要求对替代物回收率进行统计评价。


4.仪器惰性检查


当仪器被污染后,会产生大量活性位点(大多在进样口和色谱柱前端),会在样品测试过程中引起化合物的降解,如DDT会降解成DDD和DDE,异狄氏剂会降解成异狄氏剂醛和异狄氏剂酮,导致这些化合物的标准曲线呈二次曲线或测定结果有较大误差。


所以在进行有机氯农药分析之前,一定要用p,p’-DDT或异狄氏剂的单标进行惰性检查,保证降解率(计算公式见标准)在15%以内,否则应截柱子,换衬管。


每做30~50个土壤样品后,也应进行惰性检查,保证仪器状态持续合格。



六、其他一些要点


1.有丙酮存在时,水除不了,最好先转溶剂为正己烷,再除水;


2.平均相对响应因子法比最小二乘法(线性)要求严格,必须每个点都配得好;


3.土壤考核样一定要带土壤有证标准物质一起分析,基体加标样靠不住(会加标回收率正常,考核结果不合格);


4.标准里的方法检出限可以作为报告检出限用在检测报告里,若使用实验室自己的方法检出限,需要定期检查,保证能持续达到该值;


5.若试样中目标化合物浓度超出标准曲线范围,应重新提取,分取适量提取液重新处理后测定;


6.干样也要测定干物质含量,否则会影响最终结果的准确性;


7.结果的表示要严格按照标准规定(有时以考核规定为准),一般情况下回收率%前保留3位有效数字,偏差%前保留到小数点后一位。



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