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黄曲霉毒素(aflatoxins，AFs)由曲霉属真菌产生，主要是黄曲霉和寄生曲霉产生。黄曲霉主要产生黄曲霉毒素B1 (AFB1)和黄曲霉毒素B2(AFB2)，但寄生曲霉还可产生黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)。黄曲霉毒素容易在高温和湿度较大的地方产生，最易污染花生、玉米、大米等粮食作物，是具有高毒性、致突变性、致畸性和致癌性的化合物，国际癌症机构将AFB1定为Ⅰ类致癌物，且为毒性最大的致癌物。食用含有黄曲霉毒素的食品会对人体尤其是肝脏造成较大损害，急性中毒时容易引起肝脏坏死出血，慢性中毒会引起肝癌，后果十分严重。

我国十分重视食品安全，在GB 2761中对食品中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素的限量作了规定，涉及食品种类包括谷物、豆类、坚果等。同时，对食品、食用农产品中真菌毒素的检测也十分重视，农业农村部、市场监管总局都将粮食、食品中真菌毒素，尤其是黄曲霉毒素纳入检测、监测范围。现有的检测粮食、食品中黄曲霉毒素的相关标准有GB 5009.22-2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》、LS/T 6128-2017《粮食中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 超高效液相色谱法》、LS/T 6122-2017 粮油检验《粮油及制品中黄曲霉毒素含量测定 柱后光化学衍生高效液相色谱法》等。其中，GB 5009.22中检测方法多样，基质覆盖比较全面，应用也最为广泛，常作为食品安全检测的指定方法。

一  标准溶液的配制要小“心”

一般我们会将标准储备液溶于甲醇中并冷冻（-20℃）存放，一定要将标准储备液回温到室温才能再进行标准系列工作液的配制。为了不使溶剂对结果测定造成干扰，一般采用初始流动相进行梯度稀释。在进行稀释时，校准曲线的范围可以根据自己的经验进行优化，因为花生等坚果中容易有黄曲霉毒素残留，所以花生等坚果或含花生等坚果较多的食品其校准曲线最高点可以适当高些，一般食品的校准曲线最高点可以适当低些，保证在初次检测时得到更为准确地结果。

对于黄曲霉毒素含量确实较高的食品，可以在初测后进行适当稀释，保证测定浓度在校准曲线范围。作者在实验室常用的校准曲线的浓度范围为0.625 、1.250 、2.500、5.000 、10.000、20.000 、40.000 ng/mL，是一个比较宽的范围，因为方法本身灵敏度和实验室的仪器响应都比较好，大家也可以根据自己实验室的实际情况进行选择。

一定要注意的是，黄曲霉毒素有剧毒，要全程佩戴好手套、口罩等防护用品，避免接触身体其他部位的皮肤，并在通风橱操作，完成实验后建议对通风橱进行紫外线消毒，使用过的防护用品全部丢弃不用。

二  样品处理要耐“心”

我们采用的前处理方法和国标一样，没有任何偏离。准确称取5g样品(精确至0.0001 g )于50 mL离心管中，准确加入20 mL甲醇-水溶液(70+30)提取液，涡旋混匀，置于涡旋振荡器中振荡20 min，在4000 r/min下离心10 min，准确移取4 mL上清液，加入40 mL左右1% Triton X-100(吐温-20)的PBS，摇匀，待过柱净化。

制样时一定要做到样品均匀，不然平行性不好，有时候会遇到做很多平行样结果都不一致的情况，还是因为样品不均匀导致的。建议在制样时还是多取一些样品，最好不要低于1kg。

称取实验样品时，也尽量不要缩减称样量，要保证数据具有代表性。因为整个实验过程涉及到过免疫亲和柱，同时配制缓冲液也比较费时，会花费较多的时间，但是还是要保持耐心，免疫亲和柱的使用要求较高，千万不能急，整个实验过程要认真做好记录。

三  选好免疫亲和柱很省“心”

作者所在实验室具有自主制作免疫亲和柱的能力。免疫亲和柱的主要优点是具有高度特异性，可除去绝大多数干扰物质，达到低的检测限(<1 μg/kg)，还具有快速、溶剂使用少、可以自动化和再生利用的特点，广泛应用于食品和生物材料中真菌毒素的分离和净化，其制备是将特定毒素的抗体与活性固相载体结合，然后将固相载体混悬液填充进针筒柱而成。

在我们实验的净化过程中，样液中的毒素与免疫亲和柱中的抗体特异性结合十分紧密，而杂质会被水或缓冲液先洗脱，吸附的毒素用高比例有机溶剂如甲醇洗脱；对于含量低的样品，免疫亲和柱还具有浓缩净化效果，进而提高灵敏度。

目前，商品化的免疫亲和柱成本较高，仅适合几种毒素、有时需要加预柱净化，使用过程中如出现较低的回收率可能与毒素的亲和力较低或结合的抗体不足有关；极少数情况下会发生干扰物质与抗体结合而导致不正确的结果。一般商品化的免疫亲和柱在使用之前亲和柱本身会有一个柱容量和回收率的范围，如果要保证数据的准确性需要复测一下免疫亲和柱的回收率和柱容量。

大家在做实验的时候千万不能为了省钱或是省时间而不去净化，免疫亲和柱的效率可以说是净化柱中最快的了，效果也很拔尖，结果通常特别好，用好了真的十分省心。

四  样品净化要细“心”

整个提取过程可以说就是一个浓缩和净化并行的过程，在进行操作时一定要小心再小心。

免疫亲和柱保存时要保持低温，但使用时一定要恢复至室温，净化时千万不能让柱子干燥（净化时千万不能走神哟）！在此再次强调，黄曲霉毒素对人体伤害极大，一定要佩戴好手套、口罩操作。

样品净化的过程中，因为抗原抗体结合需要时间，所以提取样液中甲醇浓度要低、流速要慢，不能加压，正常流速即可，不然回收率极低。在对复杂基质进行淋洗时，最好以配置好的PBS来进行操作，亲测要比水冲洗效果更佳，此步骤可以快速过柱适当加压，达到冲洗目的，去除杂质。

为提高回收率，可以在加入洗脱液后，当洗脱液将要低落时用免疫亲和柱底部小堵头来堵住其下端，让洗脱液在免疫亲和柱内温育30~60s。

五  样品质控要用“心”

作者在做实验时，一般会做两个质控样品，一个是该批次样品的加标试验，一个是已知含量的质控样品试验。这个质控样品可以是有证标准物质，也可以是实验室中经比对定值的原有样品。

质控样品的处理保证与一般样品严格一致，进而保证试验结果的准确性。在进行加标试验时，加标量的选择很重要。一般食品中黄曲霉毒素含量较低，可以在限值、1/2限值附近进行试验，含花生等坚果较多的样品，可以在限值2~5倍限值附近进行加标试验，根据实验室以往的经验用心设计质控试验。购买的质控样品，则应按照操作手册要求进行操作试验。

六  上机操作要留“心”

一个是安全，在上机时也要严格保证安全。

另一个就是要留心自己整个操作的规范性。提前打开光化学衍生设备，检查好液相设备的稳定性，流动相是否充足，基线是否平稳，柱压是否异常，采集系统是否正常等等。要留心设备的每一个细节，保证实验最终结果的可靠性。光化学衍生法灵敏度比较高，若样品超出线性范围，一般不另配浓度更高的标准溶液，建议将样品进行稀释以满足校准要求。