PCR仪，是利用PCR技术对特定DNA进行扩增的一种仪器设备，广泛应用于医学、分子生物学实验室中。但在实验过程中，难免会遇到一些问题，本期特对PCR使用过程中的常见问题进行探讨分析，一起来看看吧~

一、基本原理 

PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外快速、大量复制特定DNA片段的技术，其基本原理模拟了细胞内的DNA半保留复制过程。DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样。

PCR实验经历阶段

阶段一：变性

PCR循环开始时，将含有模板DNA的反应体系加热至90-96℃（通常为94℃），使DNA双螺旋结构解旋成两条单链，以便后续引物结合。

阶段二：退火随后降温至45-65℃（典型值为50-60℃或针对特定引物优化的温度），在这个阶段，设计好的一对寡核苷酸引物与模板DNA单链上的互补序列结合。

阶段三：延伸最后，在72-75℃条件下（通常为72℃），热稳定DNA聚合酶（如Taq酶）从引物的3'端开始合成新的DNA互补链，沿模板方向进行延伸，生成新的双链DNA分子。

每个循环结束后，新生成的DNA分子又可以作为下一轮循环的模板，从而实现指数级别的扩增。扩增完成后，就可进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，或者进一步纯化以用于后续分析。PCR扩增技术发展至今，很多扩增条件的退火阶段和延伸阶段合并成一个阶段，温度条件通常为60℃。

二、使用中常见的问题 

1、无扩增产物表现为在琼脂糖凝胶电泳中没有出现预期大小的条带。

解决办法如下：

（1）检查模板：确保模板的质量和纯度，特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果；如果模板有问题，应重新提取或纯化模板；模板纯度正常的情况下，可适当增加模板的用量；某些情况下减少模板的用量反而能得到较好的扩增结果，可能是因为提取的DNA模板杂质含量过高，会抑制PCR反应进行。

（2）重新设计引物：使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）更换 DNA 聚合酶：酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

2、非特异性扩增表现为琼脂糖凝胶电泳结果显示出现多条非预期大小的条带。扩增产物的量低于预期，因为部分试剂和能量被用于非特异性扩增。

解决办法如下：

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

（2）优化退火温度：进行退火温度梯度实验，找到最适的退火温度，提高扩增的特异性。

（3）检查模板质量：确保模板没有降解或被污染，如有必要，重新提取或纯化模板。

（4）控制 PCR 循环数：避免过多的循环数导致非特异性扩增产物的积累。

（5）更换 DNA 聚合酶：酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（6）优化PCR程序：如采用touchdown PCR等程序，逐渐降低退火温度，提高特异性。

（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

3、空白对照或阴性对照中出现扩增产物

（1）存在交叉污染：试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

（2）引物特异性差：重新设计引物，提高特异性。

4、出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高

（1）引物设计不合适选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

（2）靶序列或扩增产物的交叉污染这种污染有两种原因：一是，整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

① 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

② 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③ 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是，空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

5、菌落PCR检测有条带，接种大摇后无条带

可重新以菌落和菌液为模板进行PCR对照检测，因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高。如果仍出现上述结果，推测可能是平板上连接液中的未连接载体的扩增引起的目的条带，进一步质粒PCR检测，可证明目的片段是否真正连接成功。

温馨提示

如果经过各种尝试重复试验后，试验结果仍然不理想，可能是PCR仪本身存在故障，可以及时联系专业工程师上门判断哦~