蛋白纯化系统作为一种专门用于蛋白质高效分离纯化的仪器，在生物医药、科研机构、生物技术等众多领域都有着广泛应用。它能够为蛋白质的研究和生产营造精准、纯净的操作环境。

蛋白纯化系统的类型划分多样。根据分离原理的不同，可以分为：离子交换层析系统、凝胶过滤层析系统、亲和层析系统等；按照操作模式来区分，有手动、半自动和全自动等类别；从适用范围来看，又可针对不同的蛋白质特性和纯化需求进行细分。

今天我们要讲的主题是AKTA蛋白纯化常见的问题与故障，喜欢的小伙伴欢迎 点赞 转发哦~

一、蛋白纯化的常见问题

01  AKTA pure与prime plus的最大耐受压力？ 

pure25是20Mpa，pure150是5Mpa；prime plus是1Mpa；紫外电导2MPa，pH电极耐压0.5MPa。

02  如何设置报警压力？ 

系统配有多柱位阀：

可以检测柱子的柱前Pre C压力，柱后Post C压力，并且计算出Delta C压力。

分别设置Pre Column Pressure和Delta Column Pressure的压力报警保护柱子。 

系统无多柱位阀：

先用管道代替柱子连接设备，在工作流速下测定系统本身的压力，此为空载压力。

Pre Column Pressure为Max Pre-Column Pressure和Max Delta Column Pressure+空载压力中较低值。

03  在正确设置了报警压后，层析柱接入AKTA，总是超压报警？ 

首先判断AKTA系统是否本身压力过高，在线滤膜或者反压阀堵塞，正常情况下反压阀空跑系统压力为0.2左右。如果系统没有问题，接入柱子出现超压，可能是柱子堵塞或者连接柱子的管线折弯造成超压，调整连接管线或者按说明书方式清洗层析柱。

04  柱子堵了，超压如何处理？

可能是因为缓冲液或样品未进行过滤、蛋白沉淀或杂质残留、清洗不及时等引起层析柱滤膜堵塞；流速过快、流动相粘度 ( 如乙醇等 ) 过高、温度过低。

解决方法：首先将柱子卸下来，确定是系统还是柱子堵了。如果是柱子堵了，参考说明书 CIP 操作进行清洁；更换层析柱顶端滤膜或超声清洗。测定柱效或重复之前做过的样品。后续，注意样品前处理（如核酸的去除、样品缓冲液条件）以及层析柱的日常维护。

05  柱子进气泡或跑干了，怎么办？

可能是由于环境温度变化；缓冲液未经过脱气；层析柱连接系统或操作不当。

解决方法：可以用大量脱气去离子水或 20% 乙醇反向高速冲洗层析柱，直到小气泡被带出（冲洗过程建议在系统连接反压阀之后进行）；如果大量进气，建议重新装柱。

06  His 标签蛋白纯化实验中，常用的缓冲液成分是什么？

建议缓冲溶液成分如下

结合缓冲溶液：

FF、HP系列：20mM磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl（避免非特异电荷吸附）， 20-50mM 咪唑（提高浓度，可以增加纯度但会降低收率），pH7.4（可以根据实际情况调节pH）。 

Talon 系列：20mM磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl，10-20mM咪唑， pH7.4。

Excel 系列：20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，pH7.4（结合缓冲液中一般不添加咪唑，在wash缓冲液中可根据样品性质加入0-30mM 咪唑）。

洗脱缓冲溶液：

20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，500mM 咪唑，pH 7.4。

07  洗脱得到的 His 标签蛋白样品的杂带较多，纯度不高，应该如何改进？

解决方法：

His 标签蛋白被部分降解：添加蛋白酶抑制剂（慎用 EDTA）；保持蛋白样品在低温下操作；缩短实验操作的时间，例如使用crude系列预装柱省略离心澄清的步骤。 

杂蛋白对于金属离子也有较强的结合：优化结合、洗脱条件（咪唑浓度、 NaCl 浓度、 pH 条件等）；尝试不同金属离子螯合的填料（例如 Co2+：HiTrap TALON crude预装柱和TALON Superflow 填料）；增加后续的纯化步骤，例如离子交换、凝胶过滤等；构建双标签目的蛋白进一步纯化。

杂质与目的蛋白存在相互作用而共洗脱：在细胞破碎前加入去垢剂或还原剂；提高Wash buffer中去垢剂浓度（2% Triton X-100或2% Tween 20）或添加甘油（20%以内）以破坏非特异性相互作用；将缓冲液的盐浓度提高至500 mM NaCl。

洗杂步骤不够充分：重复洗杂的步骤使洗杂充分。

二、蛋白纯化的常见故障

01  漏液怎么办？ 

确定漏液位置，更换finger tight并更换管道线。

02  压力异常应该如何操作？ 

压力偏低：漏液问题；矫正压力检测器；

压力偏高：检查在线滤器；矫正压力检测器；管道或者液体通过的模块有堵塞；

压力波动：泵头造成波动；层析柱造成波动；

检查在线滤器：在线过滤膜片安装在混合池里面，可以考虑更换在线膜片或者使用纯水/NaOH超声清洗；

矫正压力检测器：进行零点校正；System Control—System—Calibrate—对压力模块进行零点校正。

03  流速异常 

泵头有气泡：将阀中的液体和残留的空气抽掉，用乙醇冲洗泵；

单向阀工作不良； 

溶液中有气体：溶液使用前应脱气后再使用。

04  紫外吸收异常排查 

气泡干扰：用20ml/min流速冲洗流路，再换用0.5ml/min流速，检查紫外吸收的变化；如果紫外变化高于2mAu，则可能流路中有气泡，需要用高流速从下往上将气泡冲出； 

紫外流路池清洁：用注射器推甲醇/1M NaOH/10%表面活性剂注入紫外流动池，停留20min，用水冲洗。

温馨提示

如果遇到无法独立解决的问题，建议寻找专业的工程师上门排查解决~