高效液相色谱法（HPLC）是分析化学中广泛使用的一种技术，在医药、生命科学、食品、环境、化工等众多领域发挥着不可替代的作用。而流动相在液相色谱中犹如血液循环系统，其重要性不言而喻。合适的流动相选择与妥善的处理维护，直接关系到分析的准确性、可靠性以及仪器的使用寿命。本文将对液相色谱流动相从选择到维护进行全方位解析，希望对大家有所帮助~

一、流动相的类型与影响因素

1、流动相的类型

正相流动相：主要用于正相液相色谱，通常由非极性溶剂（如正己烷、环己烷）和少量极性改性剂（如异丙醇、二氯甲烷）组成，极性较低，与极性固定相（如硅胶柱）配合。其分离基于分析物极性差异，极性强的分析物在固定相上吸附强、在流动相中迁移慢，非极性分析物则相反。它适用于分离极性较强的化合物和异构体，对溶剂纯度要求高，极性改性剂比例对分离效果影响显著。

反相流动相：主要用于反相液相色谱，主要由水和有机改性剂（如甲醇、乙腈）构成，极性相对较高，与非极性固定相（如 C18、C8 烷基键合硅胶柱）协同作用。分离是根据分析物疏水性，疏水性强的分析物在固定相上保留时间长，极性大的分析物保留时间短、先被洗脱。它适用于分离非极性至中等极性的化合物，在药物和生化领域应用广泛，有机改性剂种类和比例以及流动相 pH 值对分离效果影响较大。

2、影响流动相分离的因素

极性：流动相的极性是影响分离的关键因素。极性流动相利于分离极性化合物，非极性流动相则适合非极性化合物。在反相色谱中，通过改变水性流动相中有机改性剂与水的比例，可调节极性。

例如：增加甲醇或乙腈比例，流动相极性降低，非极性分析物的保留时间延长，从而实现更好的分离效果。

粘度：粘度影响流动相流速和压力。较高粘度的流动相需要更高压力驱动，可能影响色谱柱寿命和分离效率。可通过改变溶剂成分、温度或压力调节粘度。

例如：降低温度可能增加某些溶剂的粘度，在实际操作中需综合考虑。

pH值：pH值影响分析物和固定相电离状态。根据分析物和固定相的 pKa 值调节 pH 值至关重要。

例如：分离酸性化合物可采用碱性流动相，使酸性分析物呈离子态，减少与固定相的作用而加快洗脱；分离碱性化合物则采用酸性流动相。

离子强度：离子强度通过改变分析物与固定相之间的静电相互作用影响分离效率。通过调整溶液中盐或缓冲液浓度可改变离子强度。例如：增加盐浓度可增强离子对作用，改变分析物保留行为。

流动相的纯度、过滤、脱气和稳定性对分析准确性和可靠性至关重要。高纯度流动相可避免杂质影响；过滤去除颗粒物和微生物；脱气防止气泡影响峰形；稳定性确保长时间使用质量不变。

二、流动相的选择与配置

流动相配制的质量直接影响到实验的结果成功与否。这里着重说一下流动相如何选择，以及影响流动相质量的过滤和脱气。

●  溶剂 / 水纯度要求

1、对 HPLC 分析的影响

实验方法方面：有机溶剂或水纯度差会影响基线，导致噪音变大、漂移，杂质产生额外紫外吸收会出现鬼峰，甚至影响分离度。水中电解质可能影响色谱峰峰形。

仪器本身方面：低质量的水或有机溶剂引入颗粒物，堵塞色谱柱或过滤芯，影响仪器性能，增加维护成本。

2. 有机溶剂纯度

应选择色谱纯溶剂，化学纯、分析纯等通用试剂纯度分类不适用于液相色谱，而农残级、光谱纯、色谱纯等是根据仪器分析技术或特殊领域分类，色谱纯溶剂可减少杂质对分析的干扰。

3. 水的纯度

推荐使用纯水仪制水，电阻率达到 18.2MΩ 方可使用。高纯度水可避免水中杂质对分析的不良影响，保障实验结果准确性。

●  过滤

1. 流动相过滤

滤膜材质多样，有适合水相、有机相及兼容两者的。但兼容滤膜易被有机相溶解，故不能用过滤水的滤膜过滤有机相或混合流动相，以免引入杂质堵塞系统。对于常规色谱柱，0.45μm 滤膜可满足要求；UHPLC 因色谱柱填料小，建议使用 0.2μm 滤膜。

2. 样品过滤

样品中的颗粒物也会堵塞系统和色谱柱，所以样品过滤必不可少。样品过滤膜也有针对水相和有机相之分及兼容类型。样品过滤建议步骤为：先吸入空气再吸入样品，翻转注射器擦净顶端残留物并固定过滤膜，过滤后注入样品瓶。

3. 在线过滤器

部分液相系统可安装在线过滤器，其筛板安装在自动进样器与色谱柱之间，可进一步保护色谱柱，拦截可能进入色谱柱的颗粒物和杂质。

●  脱气

流动相使用前必须脱气，以去除溶解气体。否则气体会降低柱填料性能，干扰检测器信号。

1. 超声波脱气

将流动相连容器放入超声水槽中脱气10 - 20min，简便且基本满足日常需求，不影响溶剂组成。但超声时需避免容器与槽底或壁接触，防止玻璃瓶破裂，且容器内液面不宜高出水面过多。

2. 氦气脱气

氦气通过流动相可有效除去溶入气体，10min 内可去除 80% - 90%。有机溶剂中气体较易脱除，水溶液中气体较难。该方法在电化学检测中常用。

3. 真空脱气

贮液器抽成部分真空使溶入气体蒸发形成气泡溢出，效果仅次于氦气脱气。目前多数高效液相色谱仪配置在线脱气机模块，但仅适用于脱气后流动相在使用过程中的微量脱气。

三、流动相的储存

流动相过滤好之后，在放置时需要注意溶剂瓶的使用。大多数有机相可以直接放置在透明瓶内，而水相、乙腈、四氢呋喃、乙醚等则建议放置在棕色瓶内。

如果水相放置在透明溶剂瓶内，光照会加速微生物的滋生。如果乙腈放置在透明溶剂瓶内，光照会加速聚合形成粘稠的聚合物，影响体系的稳定性等。

四、流动相的维护

1. 定期更换与避光流动相直接接触仪器管线和色谱柱，保持其良好状态对仪器和色谱柱性能至关重要。应定期更换流动相，预防变质。因为水、缓冲盐和大部分有机相随时间推移成分变化，极性改变，导致保留时间漂移、重现性差。

2. 缓冲盐的存放与更换缓冲盐应密封保存于棕色瓶并冷藏，可延长使用时间约一周。若保存不佳，对色谱柱影响可能不可逆，故条件允许时现用现配最为稳妥。

3. 水的更换若有机相受光照影响小，可用棕色瓶放水，建议每天换水，至少两天换一次，以减少水变质对系统和色谱柱的影响。仪器长时间不开机时，应将水换成有机相并开机置换管线内的水，防止微生物滋生。

4. 有机溶剂的稳定性部分有机溶剂如四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷等稳定性差，建议购买小体积包装，每次取完后拧紧瓶盖减少氧气影响。对于乙腈等较稳定的有机溶剂，长时间不使用仪器时，避免纯乙腈充满液相系统，防止其聚合对仪器产生不良影响。

温馨提示：

如果存在无法解决问题，建议咨询专业工程师，做进一步的故障排查；如需更换配件等，请联系专业工程师进行维修维护。