首页 > 合知行课堂

早点看完这篇文章,做“蛋白纯化”能少走多少弯路!

蛋白纯化系统作为一种专门用于蛋白质高效分离纯化的仪器,在生物医药、科研机构、生物技术等众多领域都有着广泛应用。它能够为蛋白质的研究和生产营造精准、纯净的操作环境。


蛋白纯化系统的类型划分多样。根据分离原理的不同,可以分为:离子交换层析系统、凝胶过滤层析系统、亲和层析系统等;按照操作模式来区分,有手动、半自动和全自动等类别;从适用范围来看,又可针对不同的蛋白质特性和纯化需求进行细分。


今天我们要讲的主题是AKTA蛋白纯化常见的问题与故障,喜欢的小伙伴欢迎 点赞 转发哦~


一、蛋白纯化的常见问题


01  AKTA pure与prime plus的最大耐受压力? 

pure2520Mpapure1505Mpaprime plus1Mpa;紫外电导2MPapH电极耐压0.5MPa


02  如何设置报警压力? 

系统配有多柱位阀:

可以检测柱子的柱前Pre C压力,柱后Post C压力,并且计算出Delta C压力。

分别设置Pre Column PressureDelta Column Pressure的压力报警保护柱子。 

系统无多柱位阀:

先用管道代替柱子连接设备,在工作流速下测定系统本身的压力,此为空载压力。

Pre Column PressureMax Pre-Column PressureMax Delta Column Pressure+空载压力中较低值。


03  在正确设置了报警压后,层析柱接入AKTA,总是超压报警? 

首先判断AKTA系统是否本身压力过高,在线滤膜或者反压阀堵塞,正常情况下反压阀空跑系统压力为0.2左右。如果系统没有问题,接入柱子出现超压,可能是柱子堵塞或者连接柱子的管线折弯造成超压,调整连接管线或者按说明书方式清洗层析柱。

 

04  柱子堵了,超压如何处理?

可能是因为缓冲液或样品未进行过滤、蛋白沉淀或杂质残留、清洗不及时等引起层析柱滤膜堵塞;流速过快、流动相粘度 ( 如乙醇等 ) 过高、温度过低。

解决方法:首先将柱子卸下来,确定是系统还是柱子堵了。如果是柱子堵了,参考说明书 CIP 操作进行清洁;更换层析柱顶端滤膜或超声清洗。测定柱效或重复之前做过的样品。后续,注意样品前处理(如核酸的去除、样品缓冲液条件)以及层析柱的日常维护。


05  柱子进气泡或跑干了,怎么办?

可能是由于环境温度变化;缓冲液未经过脱气;层析柱连接系统或操作不当。

解决方法:可以用大量脱气去离子水或 20% 乙醇反向高速冲洗层析柱,直到小气泡被带出(冲洗过程建议在系统连接反压阀之后进行);如果大量进气,建议重新装柱。


06  His 标签蛋白纯化实验中,常用的缓冲液成分是什么?

建议缓冲溶液成分如下

结合缓冲溶液:

FFHP系列:20mM磷酸钠缓冲溶液, 500mM NaCl(避免非特异电荷吸附), 20-50mM 咪唑(提高浓度,可以增加纯度但会降低收率),pH7.4(可以根据实际情况调节pH)。 

Talon 系列:20mM磷酸钠缓冲溶液, 500mM NaCl10-20mM咪唑, pH7.4

Excel 系列:20mM 磷酸钠缓冲溶液,500mM NaClpH7.4(结合缓冲液中一般不添加咪唑,在wash缓冲液中可根据样品性质加入0-30mM 咪唑)。

洗脱缓冲溶液:

20mM 磷酸钠缓冲溶液,500mM NaCl500mM 咪唑,pH 7.4


07  洗脱得到的 His 标签蛋白样品的杂带较多,纯度不高,应该如何改进?

解决方法:

His 标签蛋白被部分降解:添加蛋白酶抑制剂(慎用 EDTA);保持蛋白样品在低温下操作;缩短实验操作的时间,例如使用crude系列预装柱省略离心澄清的步骤。 

杂蛋白对于金属离子也有较强的结合:优化结合、洗脱条件(咪唑浓度、 NaCl 浓度、 pH 条件等);尝试不同金属离子螯合的填料(例如 Co2+HiTrap TALON crude预装柱和TALON Superflow 填料);增加后续的纯化步骤,例如离子交换、凝胶过滤等;构建双标签目的蛋白进一步纯化。

杂质与目的蛋白存在相互作用而共洗脱:在细胞破碎前加入去垢剂或还原剂;提高Wash buffer中去垢剂浓度(2% Triton X-1002% Tween 20)或添加甘油(20%以内)以破坏非特异性相互作用;将缓冲液的盐浓度提高至500 mM NaCl

洗杂步骤不够充分:重复洗杂的步骤使洗杂充分。

 

二、蛋白纯化的常见故障


01  漏液怎么办? 

确定漏液位置,更换finger tight并更换管道线。


02  压力异常应该如何操作? 

压力偏低:漏液问题;矫正压力检测器;

压力偏高:检查在线滤器;矫正压力检测器;管道或者液体通过的模块有堵塞;

压力波动:泵头造成波动;层析柱造成波动;

检查在线滤器:在线过滤膜片安装在混合池里面,可以考虑更换在线膜片或者使用纯水/NaOH超声清洗;

矫正压力检测器:进行零点校正;System ControlSystemCalibrate—对压力模块进行零点校正。

 

03  流速异常 

泵头有气泡:将阀中的液体和残留的空气抽掉,用乙醇冲洗泵;

单向阀工作不良; 

溶液中有气体:溶液使用前应脱气后再使用。


04  紫外吸收异常排查 

气泡干扰:用20ml/min流速冲洗流路,再换用0.5ml/min流速,检查紫外吸收的变化;如果紫外变化高于2mAu,则可能流路中有气泡,需要用高流速从下往上将气泡冲出; 

紫外流路池清洁:用注射器推甲醇/1M NaOH/10%表面活性剂注入紫外流动池,停留20min,用水冲洗。


温馨提示

如果遇到无法独立解决的问题,建议寻找专业的工程师上门排查解决~

© Copyright 2018 - HEZHIXING Inc. All rights reserved.       鄂ICP备18006177号-1

鄂公网安备 42011102001213 号